單細胞測序樣本制備儀，基于Drop-seq技術*，完成高通量的單細胞mRNA 3’端測序。關于單細胞RNA測序的技術教程講解，以下是我們整理的講解。
傳統(tǒng)“批量的”RNA測序方法可以一次處理成千上萬個細胞，并得到變異的平均水平。但是沒有兩個細胞是完全相同的，而scRNA-seq則可以揭示出每個細胞獨特的微妙變化，甚至可以揭示全新的細胞類型。
例如，在使用scRNA-seq技術檢測了約2,400個免疫細胞后，位于馬薩諸塞州劍橋市Broad研究所的Aviv Regev及其同事發(fā)現(xiàn)了一些具有強大T細胞刺激活性的樹突細胞，一種能夠刺激這些細胞的疫苗可能會潛在地增強免疫系統(tǒng)功能，并預防癌癥。
這些發(fā)現(xiàn)來之不易，操縱單個細胞比大群體要困難得多，而且因為每個細胞只產(chǎn)生少量的RNA，所以沒有任何犯錯的余地。此外，另一個問題是如何分析海量數(shù)據(jù)產(chǎn)生的結果，因為我們目前所使用的工具可能不是直觀的。
通常，研究人員需要費力地在Unix操作系統(tǒng)中鍵入命令來分析RNA-seq數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)文件會從一個軟件包傳遞到下一個軟件包，每個工具包在這個過程中處理其中一個步驟：基因組比對、質(zhì)量控制、變異分析等。
這個過程十分復雜，但是對于“批量的”RNA-seq來說，至少已經(jīng)形成了一種共識，即每一步哪種算法最適合，以及它們?nèi)绾芜\行。因此，現(xiàn)在已經(jīng)有了基本的流程，雖然仍有待調(diào)整，但至少對非專家來說是可處理的。在分析基因表達的差異方面，英國癌癥研究所計算生物學家Aaron Lun表示，RNA-seq的問題目前來說已基本解決。
但對于scRNA-seq來說，我們還不能妄言已經(jīng)解決：研究人員仍然在探索可以用數(shù)據(jù)集做什么、哪些算法是最有用的。
但是一系列在線資源和工具正在簡化scRNA-seq數(shù)據(jù)分析的過程。在GitHub網(wǎng)站上，一個名為“Awesome Single Cell”的頁面收錄了70多種工具和資源，涵蓋了分析過程的每個步驟。西雅圖華盛頓大學的生物學家Cole Trapnell說，該領域已經(jīng)催生了計算生物學工具的小型產(chǎn)業(yè)。
夏威夷大學的生物信息學家Lana Garmire，在去年發(fā)表的一篇評論中列出了scRNA-seq數(shù)據(jù)分析以及約48項工具的基本步驟。盡管每個實驗都不盡相同，但大多數(shù)分析流程都遵循著相同的步驟來清理和篩選測序數(shù)據(jù)，找出哪些轉錄子可以表達，并且對于擴增效率的差異是正確的。研究人員隨后進行一項或多項二級分析，以檢測亞群和其他功能。
Christina Kendziorsk，威斯康星大學麥迪遜分校的生物統(tǒng)計學家說到，在許多情況下，大規(guī)模RNA-seq中使用的工具也可以應用于scRNA-seq。但數(shù)據(jù)的根本差異意味著，這并不總是可行的。Lun表示，一方面，單細胞測序數(shù)據(jù)的背景噪聲更大。在如此少量RNA的情況下，擴增和捕獲效率的微小變化，就可能在細胞間產(chǎn)生與生物學無關的巨大差異。因此，研究人員必須對“批量效應”保持警惕，因為在不同日期制備的看似相同的細胞，可能因為純粹的技術原因而不盡相同，導致“中途退出”的基因在細胞中表達，但在測序的數(shù)據(jù)中卻沒有發(fā)現(xiàn)。
澳大利亞悉尼心臟研究所的生物信息學家Joshua Ho也談道，另一個挑戰(zhàn)是規(guī)模。典型的大規(guī)模RNA-seq實驗涉及的樣品數(shù)量較少，但scRNA-seq研究可能涉及數(shù)千個樣本。能夠?qū)κ畮讉€樣本進行處理的工具在遇到10倍或100倍數(shù)目的樣本時，處理速度往往會十分緩慢。
此外，即使是看似簡單的問題，如一個良好的細胞制備是如何構成的，在scRNA-seq的領域里也很復雜。Lun的工作流程假定大多數(shù)細胞具有大致相當?shù)腞NA豐度。但他表示，“這種假設并不一定是正確的”。例如，他談道，從未被抗原激活并且相對靜止的初始T細胞往往比其他免疫細胞具有更少的信使RNA，并且在分析過程中可能會被移除，因為程序認為沒有足夠的RNA來進行處理。
或許最重要的是，執(zhí)行scRNA-seq的研究人員傾向于從分析大量RNA的問題中提出不同的問題。“批量”的分析通常是研究基因表達在兩種或多種治療條件之間的區(qū)別。但是，研究單個細胞的研究人員通常旨在識別新的細胞類型或狀態(tài)，或重建細胞的發(fā)育途徑。Lun強調(diào)：“因為目標是不同的，所以這就需要一套不同的工具來分析數(shù)據(jù)。”
例如，單細胞分析的一種常見類型是維數(shù)約簡。該過程簡化了數(shù)據(jù)集，以便于識別類似的細胞。據(jù)英國劍橋研究所的計算生物學家Martin Hemberg所說，scRNA-seq數(shù)據(jù)將每個細胞表示為“20,000個基因表達值的列表”。 主成分分析(PCA)和t分布式隨機相鄰嵌入(t-SNE)等維度降低算法，有效地將這些特征投射到二維或三維中，使得相似的細胞簇易于分辨。另一個流行的應用程序是偽時間分析。2014年，Trapnell開發(fā)了第一個名為“Monocle”的工具。Trapnell表示，這款機器學習軟件從scRNA-seq實驗推斷出伴隨細胞分化的基因表達變化序列，這就像從空中拍攝跑步者的路徑一樣。
此外，其他工具解決了亞群檢測(例如，波士頓哈佛醫(yī)學院Peter Kharchenko開發(fā)的Pagoda)和空間定位的問題，其使用了關于組織中基因表達分布的數(shù)據(jù)來確定每個轉錄組產(chǎn)生自哪里。Rahul Satija工作于紐約基因組中心，他開發(fā)一種這樣的工具，名為“Seurat”。他表示，該軟件利用這些數(shù)據(jù)，將細胞定位為三維空間中的點。“這就是為什么我們將其命名為Seurat(Seurat為法國印象派畫家，在繪畫技法上運用畫筆一筆一筆點在畫面，這種作品被稱為點彩畫)。”他解釋說，“因為這些點讓我們聯(lián)想起了一副點彩畫。”
盡管針對特定的任務，這些工具通常涉及多種功能。例如，Rahul Satija的研究團隊通過Seurat進行了細胞亞群分析，以識別新的免疫細胞。
加州大學圣地亞哥分校的生物信息學家Gene Yeo談道，大多數(shù)的scRNA-seq工具都是基于R語言的Unix程序或軟件包編程的，但相對而言，很少有生物學家在這些環(huán)境中工作。即便是這樣，他們也可能沒有時間下載和配置所有工作，使這些工具真正發(fā)揮作用。
目前，研究人員已經(jīng)開發(fā)了一些即用型的流程。還有端到端的圖形工具，包括來自FlowJo的商業(yè)化GenSeq軟件包，以及一對開源的Web工具：來自Garmire集團的Granatum和來自瑞士聯(lián)邦理工學院Bart Deplancke實驗室的ASAP(自動單細胞分析流程)。
ASAP和Granatum使用Web瀏覽器提供相對簡單的交互式工作流程，使研究人員能夠以圖形的方式探索數(shù)據(jù)。用戶上傳了他們的數(shù)據(jù)后，軟件會逐步走完他們的步驟。對于ASAP，這意味著通過可預處理、可視化、聚類和基因表達差異分析獲取數(shù)據(jù);Granatum還允許偽時間分析和蛋白質(zhì)交互作用數(shù)據(jù)的整合。
Garmire和Deplancke也都表示，ASAP和Granatum旨在讓生物信息等多個領域的研究人員共同合作。研究人員曾經(jīng)認為，“(生物信息學家)獲取數(shù)據(jù)并產(chǎn)生結果是十分神奇的，”夏威夷大學博士生、Granatum首席開發(fā)人員Xun Zhu表示，“現(xiàn)在研究人員可以參與一些參數(shù)的調(diào)整，這是一件好事。”
當然，這些工具并不是完美的。例如，在識別細胞類型方面性能優(yōu)異的工具可能會因偽時間分析而出現(xiàn)問題。此外，加州大學伯克利分校生物統(tǒng)計學家Sandrine Dudoit強調(diào)，合適的方法是“非常依賴于數(shù)據(jù)集的”。這可能需要對方法和參數(shù)進行調(diào)整，以考慮諸如測序長度之類的變量。但Marioni談道，重要的是不要完全信任這些流程，他打比方說：“就像衛(wèi)星導航告訴你開車進入河流，但你可不能真開進河里。”
對于初學者來說，保持謹慎的態(tài)度是有道理的。生物信息學工具幾乎總是能給出答案;但問題是，這些答案究竟意味著什么?Dudoit的建議是進行一些探索性的分析，并驗證你所選擇算法的假定條件是有意義的。
Satija還談道，一些分析任務仍然頗具挑戰(zhàn)性，如在不同實驗條件或生物體間進行比較，并整合不同組學的數(shù)據(jù)。
但是，目前的工具已經(jīng)基本滿足了大多數(shù)研究人員的需求。Kendziorski建議那些感興趣的研究人員可以深入了解。每一種新的工具都可以揭示生物學的另一個方面，只要你關注科學，并做出明智的選擇。
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