常規(guī)的轉(zhuǎn)錄組分析方法通常需要103個(gè)細(xì)胞，所以無(wú)法揭示單個(gè)細(xì)胞之間基因表達(dá)的異質(zhì)性，也難以對(duì)諸如早期胚胎及異質(zhì)性的組織干細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞等極少量細(xì)胞進(jìn)行分析，而單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)為此提供了有效的研究工具。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)是在單細(xì)胞水平對(duì)全轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行擴(kuò)增與測(cè)序的一項(xiàng)新技術(shù)。本文主要就單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的操作方法、應(yīng)用成果以及進(jìn)展作一綜述。
在過(guò)去的二三十年里，基因組測(cè)序技術(shù)快速發(fā)展，人類千人基因組計(jì)劃和癌癥基因組計(jì)劃等大型測(cè)序項(xiàng)目相繼開(kāi)展。這些測(cè)序所使用的材料均為數(shù)百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的混合樣本，雖能夠得到為全基因組序列信息.但其結(jié)果顯示的只是一群細(xì)胞中信號(hào)的平均值，或只代表其中占優(yōu)勢(shì)數(shù)量的細(xì)胞信息，對(duì)單個(gè)細(xì)胞間的差異卻被忽視。對(duì)同一組織眾多細(xì)胞的測(cè)序會(huì)生成多重?cái)?shù)據(jù)，不利于追蹤細(xì)胞病變過(guò)程和細(xì)胞間狀態(tài)差異。
對(duì)臨床上諸如循環(huán)腫瘤細(xì)胞、早期發(fā)育的胚胎細(xì)胞等含量稀少的細(xì)胞而言，混合細(xì)胞群樣本·綜述·的測(cè)序方法也已不再適用。2006年，zhang在“NatureBiotechnology”上發(fā)表文章最先提出單細(xì)胞基因組測(cè)序技術(shù)，即在單個(gè)細(xì)胞水平對(duì)全基因組或轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行擴(kuò)增與測(cè)序的一項(xiàng)新技術(shù)，這在近年取得突飛猛進(jìn)的發(fā)展。本文就單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的技術(shù)原理及應(yīng)用進(jìn)展作一綜述。
1單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)
1.1單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序概述
轉(zhuǎn)錄組是指在某一特定階段，由單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序出來(lái)的全部RNA.包括mRNA和非編碼RNA[2‘3]。轉(zhuǎn)錄組學(xué)就是從IⅢA水平研究基因的表達(dá)情況，在整體水平上研究細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄的情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控的規(guī)律。與基因組不同，轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究包含了時(shí)間和空間的限定。同一細(xì)胞在不同的生長(zhǎng)時(shí)期及生長(zhǎng)環(huán)境下，其基因表達(dá)情況是不完全相同的。近幾年興起的單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)可以在單細(xì)胞水平對(duì)全轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行擴(kuò)增與測(cè)序，其原理是將分離的單個(gè)細(xì)胞的微量全轉(zhuǎn)錄組RNA進(jìn)行擴(kuò)增后進(jìn)行高通量測(cè)序。利用該技術(shù)能夠揭示單個(gè)細(xì)胞內(nèi)整體水平的基因表達(dá)狀態(tài)和基因結(jié)構(gòu)信息，準(zhǔn)確反映細(xì)胞間的異質(zhì)性.深入理解其基因型和表型之間的相互關(guān)系。單細(xì)胞基因組技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用到多個(gè)領(lǐng)域，如植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞(包括人體細(xì)胞)和微生物等。但是，
單細(xì)胞基因組測(cè)序技術(shù)仍有3個(gè)關(guān)鍵技術(shù)點(diǎn)：
第一，單細(xì)胞分離技術(shù)：
第二。單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增技術(shù);
第三，高通量測(cè)序技術(shù)。
1.2單細(xì)胞分離技術(shù)
進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序，首先要對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分離分獲得到單細(xì)胞樣品。迄今為止，已經(jīng)有多種技術(shù)方法被用于單細(xì)胞的分離，常用的單細(xì)胞分離方法主要有連續(xù)稀釋法(se曲ldilution)、顯微操作法(micromanipulation)、熒光流式分選法、激光捕獲顯微切割技術(shù)以及微流控平臺(tái)(rnjcronuidicplatfoms)。這些方法各有利弊，所以要根據(jù)具體的情況選擇合適的方法進(jìn)行分離。
1.2.1連續(xù)稀釋法
該技術(shù)通過(guò)將細(xì)胞進(jìn)行一系列的倍比稀釋最終使細(xì)胞處于單個(gè)狀態(tài)，已成功應(yīng)用在不同組織的干細(xì)胞、前體細(xì)胞體外克隆形成分析的研究中[¨-s]。此方法操作簡(jiǎn)便，且不需要特殊的設(shè)備，但是依賴于梯度稀釋計(jì)算，不是直觀的單個(gè)細(xì)胞分離.容易出現(xiàn)錯(cuò)誤。
1.2.2顯微操作法
顯微操作法是指在高倍倒置顯微鏡下，利用顯微操作器(控制顯微注射針在視野中移動(dòng)的機(jī)械裝置)進(jìn)行細(xì)胞或早期胚胎等操作的一種技術(shù)方法。此技術(shù)主要應(yīng)用于目標(biāo)細(xì)胞所在的群體數(shù)量較少的樣品分離中，能夠高效地控制單個(gè)細(xì)胞的吸取和釋放。
1.2.3熒光流式分選法
熒光流式分選法是一種通過(guò)流式細(xì)胞儀，根據(jù)細(xì)胞特異性分子標(biāo)志或者細(xì)胞光散射的特性.分選單個(gè)細(xì)胞或者特殊細(xì)胞群的技術(shù)。此技術(shù)主要的優(yōu)勢(shì)在于能夠選擇特異和非特異的分選.并且在分離單細(xì)胞時(shí)具有很高的精度和通量。
1.2.4激光捕獲顯微切割技術(shù)
激光捕獲顯微切割技術(shù)[9]是選擇性地將目標(biāo)組織切片或細(xì)胞固定在裝配有可以激光脈沖激活的熱塑膜的涂片上，其中膜包括乙烯乙酸乙烯酯膜、聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯膜和聚萘二甲酸乙二醇酯膜等，顯微鏡直視下選擇并激光切割目標(biāo)細(xì)胞。應(yīng)用此技術(shù)可以直觀地在顯微鏡下準(zhǔn)確、快速地獲取單一細(xì)胞亞群或者單個(gè)細(xì)胞，解決了組織中細(xì)胞異質(zhì)性的問(wèn)題。該技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于結(jié)腸癌、乳腺癌[u]、結(jié)核病[地]和丙型肝炎的研究中。
1.2.5微流控平臺(tái)
與其他方法比較，微流控平臺(tái)相結(jié)合單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在降低單細(xì)胞測(cè)序的噪聲以及基因組擴(kuò)展更加均勻方面具有優(yōu)勢(shì)，顯示出了良好的應(yīng)用前景。此外，微流體芯片的微量反應(yīng)容積還提高了擴(kuò)增的精確率和反應(yīng)效率。許多實(shí)驗(yàn)室開(kāi)始設(shè)計(jì)將微流控平臺(tái)用于他們的研究對(duì)象，并且有微流控平臺(tái)已經(jīng)商品化。例如，F(xiàn)1uidigm公司最近推出一款C1單細(xì)胞擴(kuò)增儀器，其原理就是在微流控芯片中進(jìn)行細(xì)胞裂解、反轉(zhuǎn)錄與cDNA擴(kuò)增，再利用轉(zhuǎn)座酶技術(shù)構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)脅z川，顯著提升了建庫(kù)通量。
1.3單細(xì)胞全轉(zhuǎn)錄組cDNA擴(kuò)增技術(shù)
全基因組擴(kuò)增是單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的關(guān)鍵步驟，對(duì)于形成足夠量的DNA片段用于測(cè)序分析起著至關(guān)重要的作用。如今已研發(fā)出多種擴(kuò)增方法.例如簡(jiǎn)并寡核苷酸引物PCR、引物延伸預(yù)擴(kuò)增PcR、連接介導(dǎo)的PCR等。尤其近年發(fā)展起來(lái)的基于多重置換擴(kuò)增和多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增單細(xì)胞測(cè)序，他們?cè)谌蚪M擴(kuò)增中有著較為廣泛的應(yīng)用。
1.3.1多重置換擴(kuò)增技術(shù)
多重置換擴(kuò)增技術(shù)最先由Dean等在2002年報(bào)道。多重置換擴(kuò)增技術(shù)作為一種不依賴于PCR的全基因組擴(kuò)增方法，近些年來(lái)得到廣泛應(yīng)用。該方法利用Phi29DNA聚合酶和隨機(jī)六聚體引物對(duì)人基因組進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增，首先隨機(jī)六堿基寡核苷酸作為引物在多個(gè)位點(diǎn)與基因組模板DNA退火，接下來(lái)Phi29DNA聚合酶在多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)開(kāi)始復(fù)制，沿著DNA模板合成DNA，同時(shí)取代模板的互補(bǔ)鏈。被置換的互補(bǔ)鏈又作為新的模板來(lái)進(jìn)行擴(kuò)增.形成一個(gè)級(jí)聯(lián)分支的放大系統(tǒng)。最終可獲得相對(duì)高分子質(zhì)量的DNA。該反應(yīng)在常溫下擴(kuò)增，避免了高溫下DNA降解對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物質(zhì)量的影響及GC含量不同引發(fā)的優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增。但是此方法的擴(kuò)增均勻性不高。多重置換擴(kuò)增技術(shù)可用于單核苷酸多態(tài)性以及突變相關(guān)的研究。
1.3.2多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)
2012年12月，哈佛大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)在Science上發(fā)表介紹多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)的文章，該技術(shù)是目前最先進(jìn)的全基因組擴(kuò)增技術(shù)。不同于以往的擴(kuò)增方法。多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增能夠從一個(gè)細(xì)胞的基因組中.分離出來(lái)自單細(xì)胞的DNA，然后添加特殊的引物，這些引物可與DNA的隨意部分互補(bǔ).從而使得它們能夠附著到DNA鏈上，充當(dāng)DNA復(fù)制起點(diǎn)。這些引物由兩個(gè)部分構(gòu)成——一個(gè)包含8個(gè)核苷酸的粘性部分變化多樣.可與DNA結(jié)合，再加上一個(gè)包含27個(gè)核苷酸的共同序列。這一共同序列通過(guò)將自身?yè)饺说叫驴截愭湥瑥亩陨沓森h(huán).防止了過(guò)度拷貝，從而大大地降低了擴(kuò)增偏倚。提高了基因組覆蓋率，可以使單細(xì)胞中93%的基因組被測(cè)序。另外，多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增的靈敏度較高。單細(xì)胞、單染色體或O.5pg的基因組DNA即可進(jìn)行擴(kuò)增.擴(kuò)增的均勻性也顯著優(yōu)于其它單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)。該技術(shù)可用于那些樣本稀少，用常規(guī)方法無(wú)法進(jìn)行基因組或轉(zhuǎn)錄組分析或者樣本高度異質(zhì)，細(xì)胞之間存在重要差異的樣本。
1.4高通量測(cè)序技術(shù)
自2005年以來(lái)，以Roche公司的454技術(shù)、111uTnina公司的Solexa技術(shù)和ABI公司的SOLiD(supportedoligo1igationdetetion)技術(shù)為標(biāo)志的高通量測(cè)序技術(shù)相繼誕生。
高通量測(cè)序技術(shù)是測(cè)序技術(shù)發(fā)展的一個(gè)里程碑，該技術(shù)可以對(duì)數(shù)百萬(wàn)個(gè)DNA分子進(jìn)行同時(shí)測(cè)序，從而使得對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能，因此也稱其為深度測(cè)序(deepsequencing)或下一代測(cè)序技術(shù)。Roche公司首先推出了基于焦磷酸測(cè)序法的超高通量基因組測(cè)序系統(tǒng)。
該單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的原理是酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)：首先將PCR擴(kuò)增的單鏈DNA與引物雜交，并與DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶、ATP雙磷酸酶、底物熒光素酶和57一磷酸硫酸腺苷共同孵育。在每一輪測(cè)序反應(yīng)中只加入一種dNrP，若該dNr：瞪與模板配對(duì)，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的焦磷酸。
焦磷酸鹽被硫酸化酶轉(zhuǎn)化為ATP，ATP就會(huì)促使氧合熒光素的合成并釋放可見(jiàn)光。電荷耦合器件檢測(cè)后通過(guò)軟件轉(zhuǎn)化為一個(gè)峰值.峰值與反應(yīng)中摻人的核苷酸數(shù)目成正比m]。隨后，IlluIIlina公司和ABI公司也相繼推出了solexa和sOLiD測(cè)序技術(shù)。正如高通量測(cè)序技術(shù)在基因組測(cè)序中發(fā)揮了強(qiáng)大的作用，它也極大地促進(jìn)了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的發(fā)展。將以上高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用到由RNA逆轉(zhuǎn)錄生成的cDNA上，就產(chǎn)生了RnA.Seq技術(shù)。
2單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用
2.1腫瘤和循環(huán)腫瘤細(xì)胞
2011年，來(lái)自冷泉港實(shí)驗(yàn)室的Navin等[拍]運(yùn)用一種單細(xì)胞測(cè)序，通過(guò)基于拷貝數(shù)變異的數(shù)據(jù)結(jié)果分析了乳腺癌的癌細(xì)胞種群結(jié)構(gòu)，指出腫瘤的進(jìn)化可能是間斷性的，挑戰(zhàn)了傳統(tǒng)的腫瘤漸進(jìn)式演化模型。
2012年，深圳華大基因研究院將其自主研發(fā)的一種解析單細(xì)胞基因組的新方法應(yīng)用于原發(fā)性血小板增多癥和腎透明細(xì)胞癌的腫瘤內(nèi)部遺傳特征的研究。
此方法解決了之前用組織樣本測(cè)序時(shí)無(wú)法解決的腫瘤高異質(zhì)性難題，為從單核苷酸水平深人研究癌癥發(fā)生、發(fā)展機(jī)制及其診斷、治療提供了新的研究思路并開(kāi)辟了新的研究方向。為了探究腫瘤的演化及遺傳特性，研究人員對(duì)取自一例典型的Mj汜基因陰性原發(fā)性血小板增多癥病人的90個(gè)單細(xì)胞進(jìn)行了全外顯子測(cè)序矧.通過(guò)分析，研究人員揭示了此原發(fā)性血小板增多癥在腫瘤發(fā)生中遵循單克隆演化模型，并鑒定了一些與原發(fā)性血小板增多癥的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的突變基因。
另外，研究人員為了更好地解析腎癌內(nèi)部的遺傳變異情況，運(yùn)用此方法對(duì)一例腎癌進(jìn)行了研究[齠]。他們發(fā)現(xiàn)此例腎癌并非由常見(jiàn)的兩個(gè)突變基因Ⅵ扎和船尉棚導(dǎo)致，說(shuō)明在病人群體中所鑒定的頻發(fā)突變可能與腫瘤個(gè)體無(wú)關(guān).同時(shí)也強(qiáng)調(diào)了在癌癥分析和診斷過(guò)程中進(jìn)行個(gè)性化治療的重要性。循環(huán)腫瘤細(xì)胞是一種從腫瘤原發(fā)灶中脫落進(jìn)入患者血液的腫瘤細(xì)胞，數(shù)量極為稀少，但與腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)有著密切關(guān)系㈣。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?yàn)槠滢D(zhuǎn)錄組分析提供了工具。
例如Daniel等利用smaIt—seq技術(shù)對(duì)單個(gè)循環(huán)系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行分析，利用各個(gè)細(xì)胞類型中微量的個(gè)體細(xì)胞找到了多個(gè)基因的不同表達(dá)，成功檢測(cè)出前列腺淋巴結(jié)癌細(xì)胞中的大多數(shù)活躍基因，并發(fā)現(xiàn)了不同的基因表達(dá)模式和生物標(biāo)記物。
2.2胚胎和器官發(fā)育
來(lái)自斯坦福大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)從一名40歲男性體內(nèi)分離出91個(gè)精子.并首次對(duì)它們進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序。研究人員通過(guò)比較這名男性的精子基因組序列和他的二倍體細(xì)胞基因組序列，觀察到單倍體精子細(xì)胞染色體中哪些地方發(fā)生了重組。研究人員也在每個(gè)精子細(xì)胞中鑒定出25個(gè)一36個(gè)新的單核苷酸突變，這些突變?cè)谶@名男性的二倍體細(xì)胞基因組中并不存在。這些隨機(jī)突變是產(chǎn)生遺傳變異的另一種方式。但是如果它們?cè)诨蚪M特定位點(diǎn)發(fā)生，那么它們能夠產(chǎn)生有害的影響。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在早期胚胎發(fā)育方面也有所應(yīng)用。例如Yall等[虬]從植入前胚胎和單個(gè)人類胚胎干細(xì)胞中選取了124個(gè)細(xì)胞，測(cè)定了它們的基因表達(dá)，并成功檢測(cè)到22687個(gè)表達(dá)的基因，其中包括8701個(gè)長(zhǎng)非編碼RNA(10ngnon—codingRNA，lncRNA)。
2.3免疫系統(tǒng)
近年來(lái)，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)開(kāi)始被應(yīng)用于免疫系統(tǒng)的研究當(dāng)中。免疫細(xì)胞對(duì)抗原物質(zhì)的應(yīng)答反應(yīng)具有復(fù)雜和不均一性的異質(zhì)性特點(diǎn)，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)有望在此方面揭示豐富的未知信息。最近Shalek等[娩]就對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的樹(shù)突狀細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)進(jìn)行了研究。脂多糖是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中的一種成分，能夠通過(guò)激活樹(shù)突狀細(xì)胞的ToⅡ樣受體引發(fā)顯著的轉(zhuǎn)錄組改變。研究者利用RNA轉(zhuǎn)錄5’末端轉(zhuǎn)換機(jī)制技術(shù)對(duì)18個(gè)小鼠骨髓來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞進(jìn)行了cDNA文庫(kù)的構(gòu)建，并進(jìn)行測(cè)序分析，他們發(fā)現(xiàn)在單細(xì)胞水平上，樹(shù)突狀細(xì)胞的反應(yīng)具有高度的異質(zhì)性[32]。許多已知的炎癥反應(yīng)基因在部分細(xì)胞中被強(qiáng)烈激活，而在其他細(xì)胞中僅被低度激活或完全未被激活，并且進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)這種反應(yīng)應(yīng)答的異質(zhì)性源于兩個(gè)方面，一方面是樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟狀態(tài)，另一方面則是基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的隨機(jī)性特征。
通過(guò)上述的實(shí)例，我們不難看出單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在疾病研究等領(lǐng)域具有重大的應(yīng)用價(jià)值。相信隨著其技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)可以揭示更多基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)、異質(zhì)性、隨機(jī)性表達(dá)等相關(guān)信息，從而更加完善地揭示更多疾病的機(jī)理，為人類戰(zhàn)勝疾病奠定理論基礎(chǔ)。
3展望
近年來(lái).單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)已經(jīng)取得了較為明顯的發(fā)展。被應(yīng)用于諸多領(lǐng)域，從最初的哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄組分析，到組織器官的發(fā)育.再到免疫系統(tǒng)和腫瘤等研究領(lǐng)域都可以見(jiàn)到單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的身影。它的廣泛應(yīng)用為科研人員研究細(xì)胞之間的異質(zhì)性帶來(lái)了希望，使人們對(duì)各種疾病的發(fā)病機(jī)理有了更為深刻和具體的認(rèn)識(shí)。
為了使單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)能夠在未來(lái)發(fā)揮更大的作用，還應(yīng)當(dāng)將其與其他技術(shù)相結(jié)合.例如細(xì)胞成像技術(shù)等。另外，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)應(yīng)當(dāng)朝著更加高通量的方向發(fā)展，在未來(lái)實(shí)現(xiàn)不單單針對(duì)單個(gè)樣品或細(xì)胞的大規(guī)模集成化的分析，從而大大節(jié)約時(shí)間和成本。最后，由于目前的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的操作過(guò)程相對(duì)比較繁瑣.過(guò)多的依賴實(shí)驗(yàn)人員的操作技術(shù)，使得該技術(shù)的效率和穩(wěn)定性都有所欠缺，為此應(yīng)當(dāng)朝著自動(dòng)化的方向進(jìn)一步發(fā)展，爭(zhēng)取實(shí)現(xiàn)整個(gè)過(guò)程的自動(dòng)操作。
總之.相信隨著單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，各技術(shù)環(huán)節(jié)的日臻完善，其必將在醫(yī)療衛(wèi)生等領(lǐng)域取得更加豐碩的成果，成為人們治療疾病、探索生命科學(xué)的一項(xiàng)必不可少的技術(shù)。
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