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實(shí)體組織制備溫和組織處理器
行業(yè)新聞 2018-11-19
　　流式細(xì)胞術(shù)作為一種可在單細(xì)胞水平上對(duì)大量細(xì)胞進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、多參數(shù)定量分析和分選的高技術(shù)，在細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)等方面的應(yīng)用日趨廣泛和深入。進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析的前提是樣品為單細(xì)胞懸液，根據(jù)不同實(shí)體組織成分的特點(diǎn)可選擇不同的分散細(xì)胞的方法，以期達(dá)到單細(xì)胞產(chǎn)量高、細(xì)胞損傷小的目的。

       在實(shí)體組織分散為單細(xì)胞的過程中，解離的方法有可能瞬間或持久地影響細(xì)胞的性質(zhì)，比如，形態(tài)上顯而易見的細(xì)胞膜破損，細(xì)胞表面上可出現(xiàn)泡狀特征，還有一些是難以觀察到的線粒體活性的變化、選擇性膜表面抗原的丟失、蛋白質(zhì)的丟失等，細(xì)胞受損程度受溫度、pH值、處理時(shí)間等多種因素的影響。機(jī)械性或人工制備的單細(xì)胞，在某些性質(zhì)上很可能已改變了原組織細(xì)胞特性，因此處理不同組織時(shí)，努力摸索方法，盡可能采用對(duì)細(xì)胞損傷小，產(chǎn)率較高的單細(xì)胞懸液制備方法，最大限度地保持細(xì)胞原有特性。

       目前將組織分離為單個(gè)細(xì)胞的傳統(tǒng)方法有機(jī)械法、酶消化法和化學(xué)法等，這些方法沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，且非常浪費(fèi)時(shí)間，獲得的細(xì)胞的活性和得率相對(duì)低很多，美天旎研發(fā)的gentleMACS組織處理系統(tǒng)結(jié)合機(jī)械法和酶消化法，使用自動(dòng)化方式可以快速溫和、安全、省時(shí)、標(biāo)準(zhǔn)化、便捷、自動(dòng)化的從組織(脾臟，肝臟，肺部，腫瘤，表皮，神經(jīng)組織....)中分離單個(gè)細(xì)胞懸液，也可將組織塊制備成勻漿(如蛋白提取，核酸提取)。下面介紹幾種溫和組織處理器方法。

溫和組織處理器

　　(一)酶消化法

　　酶的作用原理主要有三方面：一是破壞組織間的膠原纖維、彈性纖維等，二是水解組織細(xì)胞的緊密連接結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，三是水解組織粘多糖物質(zhì)。酶消化法是實(shí)體組織分散為單細(xì)胞的主要方法之一。常用的酶類有：胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、鏈霉蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、溶菌酶、彈性蛋白酶等?？筛鶕?jù)分散的組織類型確定使用的酶類。需要注意的是使用條件和影響因素(酶濃度、酶效價(jià)、作用時(shí)間、pH值)等，如胃蛋白酶在堿性環(huán)境下失去活性，胰酶在中性溶液中活性欠佳。

　　酶消化法常規(guī)程序如下：

　　1、將適合于酶消化的組織置于離心管中。

　　2、將選好的酶溶液1～2ml加入盛有被消化組織的試管中。

　　3、常規(guī)消化20～30min(恒溫37℃或室溫)，消化期間間斷振蕩或吹打。

　　4、終止消化，收集細(xì)胞懸液，以300目尼龍網(wǎng)過濾，除去細(xì)胞，以低速離心除去細(xì)胞碎片。

　　5、加入PBS 2ml充分混勻，離心棄掉上清。再加入0.5ml PBS重懸細(xì)胞。

　　6、將制備好的單細(xì)胞懸液進(jìn)行熒光標(biāo)記后上機(jī)檢測(cè)或保存?zhèn)溆谩?/span>

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　　(二)機(jī)械法

　　機(jī)械法分散實(shí)體組織包括：用剪刀剪碎組織或用鋒利的解剖刀剁碎組織，用勻漿器勻漿，用線注射針頭反復(fù)抽吸細(xì)胞等，最后用300目尼龍網(wǎng)過濾細(xì)胞得到溫和組織處理器。

　　1、剪碎法

　　(1)將組織塊放入平皿中，加入少量生理鹽水。

　　(2)用剪刀將組織剪至勻漿狀。

　　(3)加入10ml生理鹽水。

　　(4)用吸管吸取組織勻漿，先以100目尼龍網(wǎng)過濾到試管內(nèi)。

　　(5)離心沉淀1000rpm/min，4～5min，再用生理鹽水洗3次，每次以短時(shí)低速(500～800rpm/min)離心沉淀去除細(xì)胞碎片。

　　(6)以300目尼龍網(wǎng)過濾去除細(xì)胞。

　　(7)選擇適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ?70%冰乙醇等)固定細(xì)胞或低溫保存?zhèn)溆谩?br />
　　2、網(wǎng)搓法

　　(1)將100目、300目尼龍網(wǎng)扎在小燒杯上。

　　(2)把剪碎的組織放在網(wǎng)上，用眼科鑷子輕輕搓組織塊，邊搓邊用生理鹽水沖洗，直到將組織搓完。

　　(3)收集細(xì)胞懸液，離心沉淀細(xì)胞500～800rpm/min，2分鐘。

　　(4)固定細(xì)胞或低溫保存?zhèn)溆?/span>溫和組織處理器。

　　3、研磨法

　　(1)先將組織剪碎成1～2mm3小塊。

　　(2)放入組織研磨器中加入1～2ml生理鹽水。

　　(3)轉(zhuǎn)動(dòng)研棒，研至勻漿。

　　(4)加入10ml生理鹽水，沖洗研磨器。

　　(5)收集細(xì)胞懸液，并經(jīng)300目尼龍網(wǎng)過濾，離心沉淀細(xì)胞，500～800rpm/min，2分鐘，再用生理鹽水洗3遍，離心沉淀。

　　(6)固定或低溫保存細(xì)胞，備用。

溫和組織處理器

　　(三)化學(xué)處理法

　　化學(xué)處理法的主要原理是：將組織細(xì)胞間起粘連作用的鈣、鎂離子置換出來，從而使細(xì)胞分散下來。

　　1、溫和組織處理器試劑配制

　　(1)0.2%EDTA配制：將0.2gEDTA溶解于100ml Hank液中，封裝高壓消毒，置0～4℃保存。

　　(2)胰酶加EDTA配制：胰酶0.25g加PBS(pH7.0)200ml，濃度為0.125%，EDTA0.2g加PBS(pH7.0)100ml，濃度為0.2%。各取40ml混合，分裝后置0～4℃冰箱保存，使用前過濾即可使用。

　　2、實(shí)驗(yàn)方法

　　(1)將組織切成薄片，置于試管。

　　(2)首先加入EDTA液5ml，室溫下0.5小時(shí)，離心棄之。

　　(3)加入胰酶-EDTA液5～10ml，置37℃恒溫水浴30min，間斷振蕩3～5次。

　　(4)用300目尼龍網(wǎng)過濾，離心沉淀1000rpm/min，5分鐘。再以生理鹽水洗2～3次，離心500～800rpm，1～2分鐘。

　　(5)將細(xì)胞固定或低溫保存?zhèn)溆?/span>溫和組織處理器。

　　化學(xué)處理法獲得的細(xì)胞存活率低，細(xì)胞產(chǎn)量較低，細(xì)胞碎片和細(xì)胞聚集量不穩(wěn)定。

溫和組織處理器

　　(四)美天旎組織解離系統(tǒng)

　　1、使用方法：將20~4000mg大小樣本或0.3~10ml樣本與組織所對(duì)應(yīng)得解離試劑盒共同加入至組織解離管并旋緊管蓋;把解離管安裝至gentleMACS溫和組織處理器上，啟動(dòng)程序并運(yùn)行，最終得到溫和組織處理器或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

　　2、適用組織：

　　(1) 制備溫和組織處理器

　　• 人類或小鼠的腫瘤組織

　　• 小鼠或大鼠的新生心臟組織

　　• 神經(jīng)組織

　　• 小鼠的脾臟，肺，固有膜，肌肉，上皮組織，肝臟

　　• 人類或小鼠的皮膚等

　　(2)制備組織勻漿

　　• 從新鮮或凍存樣本中提取DNA，RNA

　　• 提取蛋白

　　• 分離細(xì)胞器

　　• 測(cè)定病原菌滴度等

　　3、產(chǎn)品特點(diǎn)

　　(1)溫和有效：

　　gentleMACS使用專門的一次性分離管(C管和M管)，管蓋上帶有特殊設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)子和定子，對(duì)樣本減少損傷，保證了細(xì)胞活性，同時(shí)得到了高回收率。

　　(2)一個(gè)機(jī)器支持多種用途：

　　生成溫和組織處理器和制備亞細(xì)胞物質(zhì)。C管可以得到單細(xì)胞懸液，用于細(xì)胞分選，分析或者是培養(yǎng)。M管可以將組織和細(xì)胞勻漿，用于分離亞細(xì)胞物質(zhì)(如蛋白，核酸)。

　　(3)無菌分離：

　　C管和M管的中心都有一個(gè)用隔膜封閉的小孔，能保證在無菌條件下，在封閉系統(tǒng)中安全地處理樣品。

　　(4)用戶安全：

　　針對(duì)一些感染性樣本處理采用封閉系統(tǒng)處理，比如細(xì)菌病原感染的樣本，完全不需要打開試管蓋，即可添加酶以及其他溶液，或者取出分離出來的細(xì)胞或者勻漿溶液，保護(hù)實(shí)驗(yàn)室操作人員安全。

　　(5)全自動(dòng)和標(biāo)準(zhǔn)化：

　　自動(dòng)標(biāo)準(zhǔn)化程序已經(jīng)設(shè)置好時(shí)間，速度和操作方向，只要將樣本材料和適合的溶液(如緩沖液，培養(yǎng)基等等)加入試管內(nèi)，把試管頭朝下安裝即可運(yùn)行程序。

　　(6)結(jié)果可靠：

　　標(biāo)準(zhǔn)化流程操作，減少人為操作誤差，使結(jié)果有高度可重復(fù)性。

　　(7)便捷靈活：

　　超凈臺(tái)上即可操作，方便安裝。儀器樣本容量靈活(0.3~10ml)，標(biāo)本大小20~4000mg。
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