細(xì)胞是生物結(jié)構(gòu)和功能的基本單位，種類和狀態(tài)差異很大。在大多數(shù)生物系統(tǒng)中，我們對(duì)細(xì)胞多樣性的認(rèn)識(shí)不完整，對(duì)于像神經(jīng)系統(tǒng)(腦細(xì)胞)這樣的復(fù)雜組織 。單細(xì)胞身份和功能的表征，作為對(duì)每個(gè)細(xì)胞功能能力和反應(yīng)的理解細(xì)胞類型，將加速生物學(xué)發(fā)現(xiàn)。它可能用于癌癥，用于腫瘤，幾乎任何可能在細(xì)胞群體中具有多樣性的物體。然而，今天的技術(shù)并沒(méi)有提供足夠簡(jiǎn)單的方法來(lái)同時(shí)分析大量的單個(gè)細(xì)胞。
這樣，需要快速，可擴(kuò)展的方法來(lái)表征具有許多細(xì)胞類型和狀態(tài)的復(fù)雜組織。
DROP-SEQ的原則和優(yōu)點(diǎn)：
Drop-Seq是基于使用微流控技術(shù)快速分析數(shù)千個(gè)單個(gè)細(xì)胞的策略，通過(guò)將它們封裝在微滴中進(jìn)行并行分析。
這些納升級(jí)水相室已被用于微流體裝置中的許多應(yīng)用：納米制造，乳液和泡沫，藥物遞送，但也作為用于PCR 和逆轉(zhuǎn)錄的微小反應(yīng)室 。Drop-Seq使用液滴將細(xì)胞劃分為納升級(jí)大小的反應(yīng)室，用于分析它們的mRNA轉(zhuǎn)錄物，同時(shí)使用分子條形碼策略記住轉(zhuǎn)錄物的起源細(xì)胞。利用這種技術(shù)，一位科學(xué)家每天可以同時(shí)制作10 000個(gè)單細(xì)胞文庫(kù)，同時(shí)進(jìn)行廉價(jià)且簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)。因此該方法將允許為已知的細(xì)胞類別和新的候選細(xì)胞亞型創(chuàng)建基因表達(dá)的分子圖譜。
Drop-seq利用微流體的優(yōu)勢(shì)在于：
·高吞吐量在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生;
·盡量減少昂貴樣品的消耗;
DROP-SEQ包含以下步驟
·從組織中制備單細(xì)胞懸液
·準(zhǔn)備條形碼的引物(無(wú)論是在微粒的表面，內(nèi)部)
·使用微流體裝置將每個(gè)細(xì)胞分別與微滴中的明顯條形碼化的微粒共同封裝
·一旦在液滴中分離，裂解細(xì)胞，釋放它們的mRNA，然后與引物雜交
·打破水滴并產(chǎn)生STAMPs(附著于微粒的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組)
·放大STAMP
·測(cè)序和分析：使用STAMP條形碼來(lái)推斷每個(gè)轉(zhuǎn)錄本的原始細(xì)胞
Drop-Seq可以使用兩種類型的珠子：
A. “簡(jiǎn)單”微粒
B. 水凝膠微粒
DROP-SEQ使用簡(jiǎn)單的微粒
1.從復(fù)雜的組織中制備單細(xì)胞懸液
一個(gè)復(fù)雜的組織被分解成單個(gè)細(xì)胞。
2.引物合成
微粒上的引物序列
每個(gè)微粒含有超過(guò)10 的8次方個(gè)獨(dú)立的引物，它們共享相同的“PCR處理”和“細(xì)胞條形碼”，但具有不同的獨(dú)特分子標(biāo)識(shí)符(UMI)。實(shí)際上，PCR處理是在所有引物和珠子上相同的恒定序列，其允許STAMP形成后的PCR擴(kuò)增。細(xì)胞條碼只在相同微粒的所有引物中相同，但與其他珠子上的細(xì)胞條碼不同，允許恢復(fù)細(xì)胞的來(lái)源。每個(gè)引物上不同的UMI允許mRNA轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行數(shù)字計(jì)數(shù)并識(shí)別PCR重復(fù)。最后，在所有引物序列的末端存在30-bp oligodT序列以捕獲mRNA并啟動(dòng)逆轉(zhuǎn)錄。
合成一個(gè)獨(dú)特的分子標(biāo)識(shí)符(UMI)
UMIs的合成發(fā)生在“分裂和合并”合成周期完成之后。所有微粒一起進(jìn)行八輪簡(jiǎn)并合成，每個(gè)循環(huán)期間可用全部四種DNA堿基，使得每個(gè)單獨(dú)的引物接收4,8 (65,536)個(gè)可能序列(UMI)中的一個(gè)。
3.微流體裝置
一旦單細(xì)胞懸液和微粒準(zhǔn)備就緒后，使用定制設(shè)計(jì)的微流體裝置將單個(gè)細(xì)胞與微粒一起封裝在液滴中。
該裝置在將它們分隔成不連續(xù)的液滴之前將兩個(gè)水流連接起來(lái)。層流防止在液滴形成之前混合兩種含水輸入物。一個(gè)流體包含細(xì)胞，另一個(gè)流體包含懸浮在裂解緩沖液中的條形碼化的引物珠粒。
微流體設(shè)置
用于Drop-Seq的微流體裝置的示例
流量
油：15,000μl/小時(shí)=250μl/分鐘
細(xì)胞：4,000μl/ hr?66,7μl/ min
珠粒：4,000μl/ hr?66,7μl/ min
組件列表
§ 倒置顯微鏡
§ 壓力控制器+ 3流量傳感器/三個(gè)注射泵
§ 3個(gè)falcon管/ 3mL注射器
§ 磁力攪拌系統(tǒng)
§ 微流體管用于設(shè)置元件的流體連接§ 微流體配件和連接器
§ PDMS共流微流體微滴生成裝置
§ 100微米細(xì)胞過(guò)濾器的珠子
§ 40微米細(xì)胞過(guò)濾器的細(xì)胞
§ 計(jì)數(shù)室
4.細(xì)胞裂解和RNA雜交
緊接著液滴形成后，每個(gè)細(xì)胞在液滴內(nèi)裂解并且其mRNA釋放。然后它們與其伴侶微粒表面上的引物雜交。
5. STAMPS一代
為了一次有效地生成數(shù)千個(gè)STAMP，通過(guò)添加試劑來(lái)破壞液滴以使油 - 水界面不穩(wěn)定，并且收集微粒并洗滌。然后將mRNA在一個(gè)反應(yīng)中一起逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，形成稱為“附著于微粒的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組”的(STAMP)的一組珠子。
6. STAMPS的放大
然后可以通過(guò)PCR反應(yīng)對(duì)帶有條形碼的STAMP進(jìn)行擴(kuò)增以進(jìn)行高通量mRNA測(cè)序，以分析任何期望數(shù)量的單個(gè)細(xì)胞。
7.測(cè)序和分析
使用高容量并行測(cè)序從每個(gè)末端對(duì)得到的分子進(jìn)行測(cè)序。讀數(shù)首先與參考基因組比對(duì)以鑒定cDNA的來(lái)源基因。接下來(lái)，通過(guò)它們的細(xì)胞條形碼來(lái)組織閱讀，并且每個(gè)細(xì)胞中確定的每個(gè)基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物的數(shù)量被數(shù)字計(jì)數(shù)。這就是UMI起作用的地方，避免從相同的mRNA轉(zhuǎn)錄物中重復(fù)計(jì)數(shù)序列讀數(shù)。然后可以建立數(shù)字基因表達(dá)測(cè)量矩陣(每個(gè)基因每個(gè)細(xì)胞一個(gè)測(cè)量)用于進(jìn)一步分析。
液滴下使用水凝膠微粒
關(guān)于使用水凝膠珠，操作原理或多或少保持不變，即最大的區(qū)別涉及引物，它們位于微粒內(nèi)部而不是在其表面。
為此，微流體裝置由三個(gè)通道而不是兩個(gè)組成：
§ 一個(gè)帶來(lái)珠(這整個(gè)過(guò)程的關(guān)鍵)
§ 將細(xì)胞帶入液滴中的一種
§ 一個(gè)帶來(lái)我們需要進(jìn)行分析的化學(xué)試劑
至于“簡(jiǎn)單微粒”的使用，水凝膠珠含有可用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的引物，其隨后將條形碼液滴內(nèi)細(xì)胞的內(nèi)容物條碼化。因此獲得了作為RNA序列拷貝的DNA序列集合，并且這些序列現(xiàn)在通過(guò)它們來(lái)自何處而被分類。
然后，有可能破壞液滴并將整個(gè)細(xì)胞群作為批量樣品處理，因?yàn)橹烂總€(gè)細(xì)胞都被單獨(dú)條形碼化。
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